Eigenschaften polymerbasierter Säulen
Die Auswahl einer geeigneten HPLC-Säule für eine bestimmte Anwendung ist eine entscheidende Entscheidung, um die bestmöglichen Ergebnisse hinsichtlich Trennung, Auflösung, Kosten, Analysezeit usw. zu erzielen.
Bei dieser Auswahl ist es wichtig, das Grundmaterial/die stationäre Phase zu berücksichtigen (es ist wie das „Fundament eines Gebäudes“), das im Fall von HPLC-Säulen Silica, Polymer usw. sein kann. Auf jeden Fall sollten wir es auch berücksichtigen der Trennmodus und damit die Auswahl der funktionellen Gruppe und/oder des Analyten, ohne das Anwendungsgebiet zu vergessen.
Es stimmt zwar, dass Silica-basierte Säulen für die meisten Anwendungen geeignet sind, sie weisen jedoch einige Einschränkungen auf, nämlich:
Anfällig bei extremen pH-Werten: Die meisten Säulen liefern nur Ergebnisse zwischen pH 2 und 8.
Silanolische Aktivität, d. h. Interaktion des Analyten mit den verbleibenden Silanolgruppen und Peak-Tailing als Folge. Auch die als „Fully End-Capping“ verkauften Säulen sind nicht 100 % silanolfrei und können daher kein genaues Ergebnis liefern, insbesondere wenn basische Verbindungen (z. B. Amine) analysiert werden müssen.
Diese unerwünschten Aspekte von Silica-Säulen können nur durch einen Austausch des Basismaterials, dh durch die Wahl eines pH-stabileren und silanolfreien Materials, behoben werden.
Die am häufigsten verwendeten Basismaterialien neben Kieselsäure sind Polymere. Es gibt mehrere Arten von Polymeren, die für denselben Zweck bestimmt sind, dies sind die folgenden:
Styrol-Divinylbenzol-Copolymer: sehr unpolar.
Polymethacrylat: polarer als das vorherige.
Polyvinylalkohol und Polyhydroxymethacrylat: sie können mit C18, Aminogruppen usw. funktionalisiert werden.
Gewöhnlich zeigen die polymerbasierten HPLC-Säulen mehrere Vorteile gegenüber den Silica-basierten, insbesondere in den Fällen, in denen Silica-basierte aufgrund ihrer Einschränkungen nicht verwendet werden können:
Die pH-Stabilität für Säulen auf Polymerbasis liegt meist bei pH 2-13.
Säulen auf Polymerbasis haben eine längere Lebensdauer, da das Material selbst eine starke chemische Beständigkeit aufweist. Das bedeutet am Ende einen reduzierten Preis pro Injektion.
Sehr geringes oder vernachlässigbares Bluten, wodurch sie für die MS-, LS- und CAD-Erkennung geeignet sind.
Auswahl nach HPLC-Trennmodus
Die Flüssigkeitschromatographie (LC) verwendet Flüssigkeit als mobile Phase (Elutionsmittel). Es ist eine Analysemethode, die eine Mischung von Verbindungen aufgrund ihrer physikalischen und chemischen Unterschiede trennt.
Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) ist eine Methode, die die mobile Phase unter Hochdruckbedingungen einführt, was zu schnellen und leistungsstarken Trennungen führt.
Ausschlaggebend für die Trennung sind die vielfältigen Wechselwirkungen zwischen Analyt, stationärer Phase (Packungsmaterial) und mobiler Phase.
Durch die Verwendung bestimmter Kombinationen von stationären und mobilen Phasen kann eine Vielzahl von Trennmodi erreicht werden. Die folgende Tabelle gibt einen Überblick über die am häufigsten verwendeten Trenntechniken und eine kurze Erläuterung dazu.
Reversed Phase
Chromatography
(RP)
• Die Trennung basiert auf dem Verteilungsgleichgewicht zwischen stationärer Phase und mobiler Phase.
• Die Polarität der stationären Phase ist niedriger als die der mobilen Phase.
• Typischerweise enthält die mobile Phase eine Mischung aus organischen Lösungsmitteln (Methanol, Acetonitril oder THF) und
wässrige Lösungsmittel (Wasser oder Puffer).
• Die Verwendung von mobilen Phasen mit niedrigerer Polarität beschleunigt die Elution.
Hydrophilic Interaction
Chromatography
(HILIC)
• Die Trennung basiert auf hydrophiler Wechselwirkung.
• Es wird eine stationäre Phase mit hoher Polarität verwendet.
• Typischerweise enthält die mobile Phase eine Mischung aus organischen Lösungsmitteln wie Acetonitril und wässrigen
Lösungsmittel (Wasser oder Puffer).
• Die Verwendung der mobilen Phase mit höherer Polarität bewirkt eine schnellere Elution.
• Anwendbar für die Analyse hochpolarer Substanzen.
Ion Exclusion
Chromatography
(IEX)
• Die Trennung basiert auf elektrostatischer Wechselwirkung (Abstoßung) zwischen dem Ionenaustauscher und ionischen gelösten Stoffen.
• Dissoziierte ionische Moleküle eluieren schneller als nicht dissoziierte Formen.
• Wird hauptsächlich für die Analyse von organischen Säuren verwendet.
Ion Chromatography
(IC)
• Die Trennung basiert auf elektrostatischer Wechselwirkung (Bindung) zwischen dem Ionenaustauscher und ionischen gelösten Stoffen.
• Elektrischer Leitfähigkeitsdetektor kann mit einer mobilen Phase mit niedriger Salzkonzentration verwendet werden.
• Wird hauptsächlich für die Analyse anorganischer Verbindungen verwendet.
Size Exclusion
Chromatography
(SEC) /
Gel Permeation Chromatography
(GPC)
• Netzwerke oder Poren auf der Oberfläche des Verpackungsmaterials wirken als Molekularsieb zur Trennung von Molekülen
basierend auf ihren Größen.
• Um Moleküle nur anhand ihrer Größe zu trennen, bedarf es einer analytischen Bedingung ohne jegliche
Verbindungen und Packungsgel-Wechselwirkung.
• Je größer die Molekülgröße, desto schneller die Elutionssequenz.
• Zur Bestimmung des Molekulargewichts oder der Molekülverteilung von Makromolekülen und deren Qualifizierung
Oligomere.
Ion Exchange
Chromatography
(IEC)
• Die Trennung basiert auf elektrostatischen Wechselwirkungen zwischen dem Ionenaustauscher und ionischen gelösten Stoffen.
• Die mobile Phase der Wahl sollte eine ausreichende Pufferkapazität bei dem pH-Wert haben, der die größte erzeugt
Ladungsunterschiede zwischen dem interessierenden Analyten.
• Die Elutionsposition wird optimiert, indem der pH-Wert, die Salzkonzentration und/oder die Ionenstärke des Mobiles variiert werden
Phase.
Allgemeine Vorsichtsmaßnahmen für die Säulenhandhabung
Für die beste Leistung der Säule befolgen Sie bitte die nachstehenden Anweisungen.
Vorbereitung des HPLC-Systems
• Waschen Sie das gesamte LC-System vor der Säuleninstallation, einschließlich aller Flussleitungen und Probenschleife, indem Sie das Ventil umschalten, und ersetzen Sie dann die Waschlösung durch den zu verwendenden Eluenten.
• Wenn der gewünschte neue Eluent eine geringe Mischbarkeit/Löslichkeit mit dem Eluenten der vorherigen Analyse aufweist, verwenden Sie zuerst den Eluenten, der mit beiden Eluenten mischbar/löslich ist, und ersetzen Sie ihn dann durch den gewünschten Eluenten.
*Wenn der im System verbleibende Eluent nicht mit der zu verwendenden Säule kompatibel ist, kann die Säule beschädigt werden.
*Eine drastische Änderung der Eluentenzusammensetzung kann vom System adsorbierte Substanzen entfernen und sie können in die Säule eindringen und diese beschädigen.
Säuleninstallation
• Verbinden Sie die Säule mit dem LC-System, indem Sie dem „Pfeil in Flussrichtung“ ( ) folgen, der auf dem Typenschild der Säule angegeben ist. Wenn eine Vorsäule verwendet wird, positionieren Sie die Vorsäule vor (vor dem Einlass) der analytischen Säule.
• Stellen Sie sicher, dass Sie den Schlauch bis zum Endanschluss einführen und mit der Überwurfmutter sichern. Es ist wichtig, dass zwischen dem Schlauch und der Säulenseite des Endfittings kein zusätzlicher Platz vorhanden ist. Das Vorhandensein eines zusätzlichen Zwischenraums lässt das Sample sich ausbreiten und kann zu breiten Peaks führen.
• Stellen Sie die Anfangsflussrate auf weniger als die Hälfte der empfohlenen Flussrate ein und starten Sie das System. Wenn Sie die Säule bei erhöhter Temperatur verwenden, halten Sie eine niedrige Flussrate, bis die Temperatur der Säule die eingestellte Temperatur erreicht, und erhöhen Sie dann die Flussrate allmählich auf den gewünschten Wert.
*Stellen Sie sicher, dass kein Lösungsmittel austritt. Dies kann zu elektronischen Leckagen, Rost und/oder chemischen Verletzungen führen.
*Stellen Sie sicher, dass keine Luftblasen in die Säule eindringen, während Sie die Säule installieren. Die Luftblasen können die Säule beschädigen.
* Wenn Sie das System nach der Säuleninstallation oder nach dem Anhalten des Eluentenflusses neu starten, starten Sie das System mit weniger als der Hälfte der empfohlenen Flussrate. Ein schneller Druckanstieg kann die Säule beschädigen.
* Wenn die Säule bei erhöhter Temperatur verwendet wurde, verringern Sie die Flussrate am Ende der Analyse auf weniger als die Hälfte der empfohlenen Flussrate. Schalten Sie dann den Säulenofen aus und lassen Sie die Säulentemperatur auf Raumtemperatur zurückkehren, bevor Sie die Pumpe stoppen. Wenn die Pumpe gestoppt wurde, während der Eluent in der Säule noch heiß war, verringert sich mit sinkender Temperatur des Eluenten auch dessen Volumen. Dies kann zur Schaffung eines leeren Raums in der Säule führen und die Säule verschlechtern.
*Es wird empfohlen, den Pumpenbegrenzer einzustellen, um eine Überschreitung des maximalen Drucks zu vermeiden.
Lösungsmittelaustausch
• Starten Sie das System beim Ersetzen des Lösungsmittels mit weniger als der Hälfte der empfohlenen Flussrate. Das empfohlene Lösungsmittelvolumen zur Einführung bei jedem Schritt beträgt das 3- bis 5-fache des Säulenvolumens.
• Mischbarkeit/Löslichkeit des gewünschten neuen Lösungsmittels und des aktuell in die Säule eingefüllten Lösungsmittels prüfen.
• Wenn Sie das aktuelle Lösungsmittel durch ein Lösungsmittel mit geringer Mischbarkeit/Löslichkeit mit dem aktuellen Lösungsmittel ersetzen, verwenden Sie zuerst ein Lösungsmittel, das mit beiden Eluenten mischbar/löslich ist, und ersetzen Sie es dann durch das neue Lösungsmittel.
• Bei Verwendung einer Gradientenmethode können Änderungen in der Zusammensetzung des Eluenten den Säulengegendruck erhöhen. Passen Sie die Flussrate und die Säulentemperatur so an, dass der Säulengegendruck unter dem nutzbaren Maximaldruck bleibt.
Säulenlagerung
• Entfernen Sie die Säule aus dem System, nachdem Sie das In-Säulen-Lösungsmittel durch das Versandlösungsmittel ersetzt haben. Ziehen Sie die Endkappen fest und lagern Sie die Säule an einem Ort mit stabiler Temperatur (ein kühler und dunkler Raum wird empfohlen).
* Lassen Sie das Innere der Säule niemals trocknen. Es kann die Säule beschädigen.
Zusätzliche Warnungen
• Endstücke nicht entfernen.
• Üben Sie keine starken Stöße auf die Säule aus. Lassen Sie die Säule nicht fallen und stoßen Sie sie nicht auf eine harte Oberfläche.
*Lesen Sie die Bedienungsanleitung, bevor Sie die Säule verwenden.
Säuleninspektion
Die Prüfmethode ist im Analysenzertifikat (CoA) beschrieben.
Die theoretische Plattenzahl (N) und der Asymmetriefaktor (Fas) wurden unter Verwendung der nachstehenden Gleichungen berechnet.
• Theoretische Plattenzahl (N)
• Asymmetriefaktor (Fas)
